丙酮酸羧化酶（PC）活性检测试剂盒说明书（微量法）

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

规格：100T/96S

产品内容：

提取液：液体 110mL×2 瓶，4℃保存； 

试剂一：液体 15mL×1 瓶，4℃保存； 

试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 3mL 蒸馏水；可分装后-20℃保存，避免冻融；

试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 2mL 蒸馏水；可分装后-20℃保存，避免冻融；

试剂五：粉剂×1 支，4℃保存；临用前加入 2mL 蒸馏水； 

试剂六：粉剂 5mg×1 支，4℃保存；临用前加入 2.5mL 试剂六稀释液充分溶解；

试剂六稀释液：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
试剂七：液体 1mL×1 支，4℃保存；

产品说明：
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中， 但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。是供给草酰乙酸的主要补充反应，是糖异生过程的第一个限速酶。
PC 不可逆的催化丙酮酸、ATP、CO2 和水生成草酰乙酸、ADP 和 Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和 NADH 生成苹果酸和 NAD+，产生的NAD+与特异的显色剂反应，产生在450nm处有最大吸收峰的黄色物质，通过检测该黄色物质在450nm的增加速率，即可反映 PC 活性。
试验中所需的仪器和试剂：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、粗酶液提取：
取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1.0 mL 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
4℃1000 g 离心 10min。
将上清液移至另一离心管中，4℃11000 g 离心 15min。
上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 PC（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。在沉淀中加入 1mL 提取液，超声波破碎（功率 20％，超声 5 秒，间隔 10 秒，重复 12 次），用于 PC 活性测定，并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤：
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 450nm，蒸馏水调零。
2、 试剂一用前 37℃孵育 15min。
3、 工作液的配制：按照试剂二：试剂三：试剂四=2:1:1 的体积比例充分混匀，现用现配。
4、 操作表：在 1mL 石英比色皿中分别加入下列试剂：

按样本鲜重计算：
 酶活定义：每克样品每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PC 酶活（U/g 鲜重）=△A1÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T 
ΔA1：上清测定值；ε：特异性底物的消光系数，3.1×104 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总： 反应体系总体积，2×10-4L；V 样：反应体系中样本体积，0.01mL；V 提取：加入的提取液体积，1mL； T：反应时间：10min；W：样本鲜重，g。
B、沉淀中 PC 活力的计算:
按样本鲜重计算：
酶活定义：每克样品每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PC 酶活（U/g 鲜重）=△ A2÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T
ΔA2：上清测定值；ε：特异性底物的消光系数，3.1×104 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总： 反应体系总体积，2×10-4L；V 样：反应体系中样本体积，0.01mL；V 提取：沉淀重悬体积，1mL；T： 反应时间：10min；W：样本鲜重，g。
C、样本 PC 总活力的计算:
样本 PC 总活力即为上清中 PC 活力与沉淀中 PC 活力之和。

按样本鲜重计算：
PC（U/g 鲜重）=沉淀中 PC 活力+上清中 PC 活力。
按 96 孔 UV 板计算：
将上述计算公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm 进行计算即可。