锰过氧化物酶试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-385

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

锰过氧化物酶（EC1. 11. 1. 13）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，主要存在于担子菌中，属于木质素降解酶系，能有效的降解木质素及废水和土壤中比较难降解的氯化物，叠氮化合物、 DTT ，多环芳烃等。

测定原理

锰过氧化物酶在 Mn²⁺ 存在的条件下，将愈创木酚氧化为四邻甲氧基连酚，在 465nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅。

试剂组成和配制

试剂一：液体 75mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 11mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。

酶液提取

1、组织：按照质量（g）：试剂一体积(mL)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g ，加入 1mL 试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于4℃ , 10000g 离心 10min ，取上清置于冰上待测。

2、细胞：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为 500~ 1000： 1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w ，超声 3 秒，间隔 7 秒， 总时间 3min）；然后 4℃ , 10000g 离心 10min ，取上清置于冰上待测。

3、培养液或其它液体：直接检测。

测定操作

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 465nm ，蒸馏水调零。

2、测定前将试剂一、二、三、四在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）放置 10min 以上。

3、样本测定表

在 1 mL 玻璃比色皿中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录 465nm 下 30s 时的吸光值 A1 和 2min30s 后的吸光值 A2 。计算ΔA ＝A2-A1。

注意：

若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三、四按比例配成混合液，在 37℃（哺 乳动物）或 25℃（其它物种）放置 10min 以上，测定时加入 100µL 样本和 900µL 混合液测定。

酶活计算公式

1、按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP 活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V 反总÷ (ε×d） ×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=413×ΔA÷Cpr

2、按照样本质量计算

酶活性定义：每克样品每分钟氧化 1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP 活性（nmol/min/g  鲜重）= [ΔA×V 反总÷  (ε×d）×10⁹] ÷（V 样×W÷V 样总）÷T

= 413×ΔA÷W

3、按照细胞数量计算

酶活性定义：每 10⁴ 个细胞每分钟氧化 1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP 活性（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反总÷ (ε×d） ×10⁹] ÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T

= 413×ΔA÷细胞数量

4、按照液体体积计算

酶活性定义：每毫升培养液每分钟氧化 1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。 

MnP 活性（nmol/min/mL）= [ΔA×V 反总÷ (ε×d） ×10⁹]÷V 样÷T

= 413×ΔA

ε：愈创木酚摩尔消光系数：12100L/mol/cm；d： 比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积， 1×10-3L；V 样：反应中样本体积，0. 1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋 白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min