中性蛋白酶（Neutral protease, NP） 活性测定试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-360

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

NP 在一定的温度和中性 pH 条件下，催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点，中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。

测定原理：

中性条件下，NP 催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；在 680nm 有特征吸收峰。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1mL 玻璃比色皿、1.5 mL EP 管和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 90mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加 10 mL 蒸馏水溶解。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入 20 mL 试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。（可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热 15-30 分钟，该试剂为过 饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用）。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加50 mL 蒸馏水溶解。

试剂五：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。

标准品：液体 1mL×1 支，0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液，4℃保存。

粗酶液提取：

1、组织： 按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1： 5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清， 即粗酶液。

2、血清或培养液：直接测定。

3、细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）： 试剂一体积（mL）为 500~1000： 1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃,离心 10min， 取上清置于冰上待测。

测定操作：

1、分光光度计预热 30min，调节波长到 680 nm，蒸馏水调零。

2、试剂二、试剂三和试剂四置于 30℃水浴保温 30min。

3、对照管：取一支 EP 管，加入 100μL 粗酶液，200μL 试剂二，混匀后置于 30℃水浴保温 10min；加入 200μL 试剂三，混匀后 8000g，  4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入新的 EP 管，再加入 1000μL 试剂四，200μL 试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温 20min，于 680nm 测定光吸收，记为 A 对照管。

4、测定管：取一支 EP 管，加入 100μL 粗酶液，200μL 试剂三，混匀后置于 30℃水浴保温 10min；加入 200μL 试剂二，混匀后 8000g，  4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入新的 EP 管，再加入 1000μL 试剂四，200μL 试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温 20min，于 680nm 测定光吸收，记为 A 测定管。（注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二）

5、空白管：取 EP 管，加入 200μL 蒸馏水，1000μL 试剂四，200μL 试剂五，混匀后置于 30℃ 水浴保温 20min，于 680nm 测定光吸收，记为 A 空白管。

6、标准管：取 EP 管，加入 200μL 标准品，1000μL 试剂四，200μL 试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温 20min，于 680nm 测定光吸收，记为 A 标准管。

注意：空白管和标准管只需要测定一次。

计算公式：

1、按照样本蛋白浓度计算

NP 活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生 1nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。

NP 活性（nmol/min /mg prot）= C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管） ×V 反总÷(Cpr×V1)÷T

= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷Cpr

2、按照样本质量计算

NP 活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生 1 nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。

NP 活性（nmol/min /g 鲜重）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管） ×V 反总÷（W×V1÷V2）÷T

= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷W

3、按照液体体积计算

NP 活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生 1nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。

NP 活性（nmol/min/mL）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总÷V1÷T

= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）

4、按照细胞数量计算

NP 活性单位定义：30℃每 10⁴ 个细胞每分钟催化水解产生 1nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。

NP 活性（nmol/min /10⁴ cell）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管） ×V 反总÷（细胞数量×V1÷V2）÷T

= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷细胞数量

C 标准品：0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液；V 反总： 酶促反应总体积，0.5mL；Cpr：粗酶 液蛋白质浓度（mg/mL）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），0.1 mL；V2 ：提取液总 体积（mL）， 1mL； T：催化反应时间（min）， 10min；W：样品质量（g）。

注意事项：

临用前配制的试剂配制好后 4℃保存，并且 3 天内使用完毕。