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产品名称:碱性蛋白酶检测试剂盒

产品规格:50管/24样,100管/48样

产品货号:LE-1-361,LE-2-361

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

LE-1-361

碱性蛋白酶测试盒

分光光度法

50/24

550

LE-2-361

碱性蛋白酶测试盒

微量法

100/48

1000

碱性蛋白酶(AKP)活性检测试剂盒说明书(分光光度法

货号:LE-1-361

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

AKP 是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类,属于丝氨酸蛋白酶。此外,该酶还能够水解酯键、酰胺键,具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一,广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。

测定原理:

在碱性条件下,AKP 水解酪蛋白生成酪氨酸;在碱性条件下 ,酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝;钨蓝在 680nm 有特征吸收峰,测定 680nm 吸光度增加速率,来计算 AKP 活性。

自备仪器和用品:

可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 mL EP管、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体 90mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加 10 mL 蒸馏水溶解。

试剂三:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入 20 mL 试剂一,沸水浴中磁力搅拌溶解。(可 在烧杯上盖一层保鲜膜,注意观察,避免水分全部蒸发,一般加热 15-30 分钟,该试剂为过 饱和试剂,充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用)。

试剂四:粉剂×1瓶, 4℃保存。临用前加50 mL 蒸馏水溶解。

试剂五:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。

标准品:液体 1mL×1 支,0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液,4℃保存。

粗酶液提取:

1组织: 按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1: 5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL 试剂一)冰浴匀浆,8000g,4℃离心 10min,取上清, 即粗酶液。

2血清或培养液:直接测定。

3细菌、真菌:按照细胞数量(104 个): 试剂一体积(mL)为 500~1000: 1  的比例(建  500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min, 取上清置于冰上待测。

测定操作:

1、分光光度计预热 30min,调节波长到 680 nm,蒸馏水调零。

2、试剂二、试剂三和试剂四置于 40℃水浴保温 30min。

3、对照管:取一支 EP 管,加入 100μL 粗酶液(血清或培养液),200μL 试剂二,混匀后置  40℃水浴保温 10min;加入 200μL 试剂三,混匀后 8000g 4℃离心 10min;取 200μL 上 清液,加入新的 EP 管,再加入 1000μL 试剂四,200μL 试剂五,混匀后置于 40℃水浴保温 20min,于 680nm 测定光吸收,记为 A 对照管。

4、测定管:取一支 EP 管,加入 100μL 粗酶液(血清或培养液),200μL 试剂三,混匀后置  40℃水浴保温 10min;加入 200μL 试剂二,混匀后 8000g 4℃离心 10min;取 200μL 上 清液,加入新的 EP 管,再加入 1000μL 试剂四,200μL 试剂五,混匀后置于 40℃水浴保温 20min,于 680nm 测定光吸收,记为 A 测定管 。(注意与对照管不同,先加试剂三,后加试剂二)

5、空白管:取一支 EP 管,加入 200μL 蒸馏水 , 1000μL 试剂四200μL 试剂五,混匀后置于40℃水浴保温 20min,于 680nm 测定光吸收,记为 A 空白管。

6、标准管: EP 管,加入 200μL 标准品,1000μL 试剂四,200μL 试剂五,混匀后置于40℃ 水浴保温 20min,于 680nm 测定光吸收,记为 A 标准管。

注意:空白管和标准管只需要测定一次。

计算公式:

1按照样本蛋白浓度计算

AKP 活性单位定义:30℃每毫克蛋白每分钟水解产生 1nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。

AKP 活性(nmol/min /mg prot)= C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 反总÷(Cpr×V1)÷T

= 125×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr

2、按照样本质量计算

AKP 活性单位定义:30℃每克样品每分钟催化水解产生 1 nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。

AKP 活性(nmol/min /g 鲜重)=C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 反总÷(W×V1÷V2)÷T

= 125×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W

3按照液体体积计算

AKP 活性单位定义:30℃每毫升样品每分钟催化水解产生 1nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。

AKP 活性(nmol/min/mL)=C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 反总÷V1÷T

= 125×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)

4按照细胞数量计算

AKP 活性单位定义:30℃每 104 个细胞每分钟催化水解产生 1nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。 

AKP 活性(nmol/min /104  cell)=C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白  管)×V 反总÷(细胞数量×V1÷V2)÷T

= 125×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空  白管)÷细胞数量

C 标准品:0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液;V 反总: 酶促反应总体积,0.5mL;Cpr:粗酶 液蛋白质浓度(mg/mL);V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),0.1 mL;V2 :提取液总 体积(mL), 1mL; T:催化反应时间(min), 10min;W:样品质量(g)。

注意事项:

临用前配制的试剂配置好后 3 天内使用完毕


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