糜蛋白酶（ Chymotrypsin）试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-358

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

糜蛋白酶，又称胰凝乳蛋白酶，是胰腺分泌的一种蛋白水解酶，能迅速分解变性蛋白质。糜蛋白酶的功能与胰蛋白酶相似，但是具有分解能力强、毒性低和不良反应小等优点。临床上糜蛋白酶用于痰液稀化， 对脓性和非脓性痰液均有效；也用于创伤或手术后伤口愈合，如白内障摘除。

测定原理：

糜蛋白酶催化 ATEE 水解，产物在 237 nm 有特征光吸收；通过测定 237 nm  光吸收增加速率，来计算糜蛋白酶活性。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 50ml ×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂 ×1 瓶 ，4℃避光保存，临用前加入 50 ml 蒸馏水充分溶解。

自备仪器和用品：

紫外分光光度计 、 台式离心机 、水浴锅 、可调式移液器 、 1ml 石英比色皿 、研钵 、冰和蒸馏水。

粗酶液提取：

组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1ml 试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即粗酶液。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min，调节波长到 237 nm，蒸馏水调零。

2、试剂二置于 37℃水浴中保温 30min。

3、空白管：取 1mL 石英比色皿，加入 100μL 试剂一 ，1000μL 试剂二，混匀于 237nm 测定 4min 内吸光值 变化，记为△A 空白管 。（从吸光值稳定增加开始计时）

4、测定管：取 1mL 石英比色皿，加入 100μL 粗酶液，1000μL 试剂二，混匀于 237nm 测定 4min 内吸光值 变化，记为△A 测定管 。（从吸光值稳定增加开始计时）

注意 ：空白管只需要测定一次。

糜蛋白酶活性计算公式：

1、按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃每毫克蛋白每分钟催化吸光值增加 1 为一个酶活单位。

糜蛋白酶（U/mg prot）= (△A 测定管-△A 空白管) ×V 反总÷(Cpr×V1)÷T 

=2.75×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/ml），需要另外测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（ml），100μl=0.1 ml； V 反总：反应总体积， 1100μl= 1. 1ml；T：反应时间（min） ，4min。

2、按照样本质量计算

活性单位定义：25℃每克样品每分钟催化吸光值增加 1 为一个酶活单位。 

糜蛋白酶（U/g 鲜重）=(△A 测定管-△A 空白管)×V 反总÷(W×V1÷V2)÷T

=2.75×(△A 测定管-△A 空白管)÷W

W：样品质量（ g） ；V1：加入反应体系中粗酶液体积（ml） ， 100μl=0.1 ml；V2：粗酶液总体积（ml），1 ml；V 反总：反应总体积， 1100μl= 1. 1ml；T：反应时间（min） ，4min。

注意事项：

临用前配制的试剂配置好后 3 天内使用完毕。