产品名称:丙酮酸激酶(PK)测试盒
产品规格:50管/48样,100管/96样
产品货号:YX-C-B201,YX-W-B201
免费咨询:0551-66107970
货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价(元) |
YX-C-B201 |
丙酮酸激酶(PK)测试盒 |
可见分光光度法 |
50管/48样 |
450 |
YX-W-B201 |
丙酮酸激酶(PK)测试盒 |
微量法 |
100管/96样 |
880 |
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
PK(EC 2.7.1.40)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化糖酵解过程中的最后一步反应,是糖酵解过程中的主要限速酶之一,也是产生 ATP 的关键酶之一,因此测定PK 活性具有重要意义。
测定原理:
PK 催化磷酸烯醇式丙酮酸和 ADP 生成 ATP 和丙酮酸,乳酸脱氢酶进一步催化 NADH 和丙酮酸生成乳酸和 NAD+,在 340nm 下测定 NADH 下降速率,即可反映 PK 活性。
自备实验用品及仪器:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂的组成和配制:
提取液:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 45mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1 支,-20℃保存;
试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加入 1.5mL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂四:液体 45μ L×1 支,4℃保存;临用前加入 900μ L 蒸馏充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
样本的前处理:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、工作液的配制:临用前将试剂二转移至试剂一中,充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
3、将工作液、试剂三和试剂四 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10 分钟。
4、加样表:
试剂名称(μ L) |
测定管 |
工作液 |
900 |
试剂三 |
30 |
试剂四 |
15 |
样本 |
30 |
将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中,立即混匀,加样本的同时开始计时,在 340nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度A1 和 2 分 20 秒时的吸光度 A2,计算 Δ A=A1-A2。
PK 活性计算:
1、血清(浆)中 PK 活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。PK(nmol/min/mL)=[Δ A×V 反总÷(ε ×d)×109]÷V 样÷T=2613×Δ A
2、组织、细菌或细胞中 PK 活力的计算:
按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PK(nmol/min /mg prot)=[Δ A×V 反总÷(ε ×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=2613×Δ A÷Cpr
按样本鲜重计算:
单位的定义:每g 组织每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。
PK(nmol/min /g 鲜重)=[Δ A×V反总÷(ε ×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=2613×Δ A÷W
按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PK( nmol/min /104 cell )= [Δ A×V 反总 ÷ ( ε ×d ) ×109]÷(500×V 样 ÷V 样总)÷T=5.226×Δ A
V 反总:反应体系总体积,9.75×10-4 L;ε :NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm; d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.03 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T: 反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数, 500 万。
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