产品名称:果糖-6-磷酸激酶/6-磷酸果糖激酶/磷酸果糖激酶(PFK)测试盒
产品规格:50管/48样,100管/96样
产品货号:LE-1-235,LE-2-235
免费咨询:0551-66107970
货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价(元) |
LE-1-235 |
果糖-6-磷酸激酶/6-磷酸果糖激酶/磷酸果糖激酶(PFK)测试盒 |
分光光度法 |
50管/48样 |
680 |
LE-2-235 |
果糖-6-磷酸激酶/6-磷酸果糖激酶/磷酸果糖激酶(PFK)测试盒 |
微量法 |
100管/96样 |
1300 |
货号:LE-1-235
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
PFK(EC 2.7.1.11 )广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中, 负责将果糖-6-磷酸和 ATP 转化为果糖-1,6 二磷酸和 ADP,是糖酵解过程的关键调节酶之一。
测定原理
PFK 催化果糖-6-磷酸和 ATP 生成果糖-1,6-二磷酸和 ADP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化 NADH 氧化生成 NAD+ ,在 340nm 下测定 NADH 下降速率,即可反映 PFK 活性。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、 1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸 馏水。
试剂的组成和配制
提取液:60mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 40mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1瓶 ,-20℃保存,临用前加入 2.8mL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分 装后-20 度保存,禁止反复冻融;
试剂三:粉剂×1支,4℃保存,临用前加入 260μL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装 后-20 度保存,禁止反复冻融;
试剂四:液体 16μL×1 支,4℃保存, 临用前加入 260μL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试 剂分装后-20 度保存,禁止反复冻融;
样本的前处理
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 1000~5000: 1 的比例(建议 2000 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织: 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1 :5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL 提取液), 进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤和加样表
1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、工作液(可测 25 个样) 的配制:取 19mL 试剂一和 1.26mL 试剂二充分混匀; 用不完的 试剂分装后-20 度保存,禁止反复冻融;
3、将工作液置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10 分钟。
4、加样表:
试剂名称 (μL) |
测定管 |
工作液 |
800 |
样本 |
30 |
试剂三 |
5 |
试剂四 |
5 |
将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中,立即混匀,加试剂四的同时开始计时,记录在 340 nm 波长下 20 秒时的初始吸光度 A1 和 10 分 20 秒时的吸光度 A2,计算 ΔA=A1-A2。
注意:
不同匀浆组织中 PFK 活力不一样,做正式试验之前请做 1-2 只预试,若 ΔA>0.5,则说明活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数), 或缩短反应时间至 2min 或 5min,使 ΔA<0.5,以提高检测灵敏度。
PFK 活力单位的计算
1、血清(浆)PFK 活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/mL) =[ΔA×V 反总÷ (ε×d)×109]÷V 样÷T=450×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 PFK 活力计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖 -1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/mg prot) =[ΔA×V 反总÷ (ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=450×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每 g 组织每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6- 二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/g 鲜重) =[ΔA×V 反总÷ (ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=450×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/104 cell) =[ΔA×V 反总÷ (ε×d)×109÷(2000×V 样÷V 样总)÷T=0.225×ΔA
V 反总:反应体系总体积,8.4×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm; d: 比色皿光径, 1cm;V 样:加入样本体积,0.03 mL;V 样总:加入提取液体积, 1 mL; T: 反应时间, 10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;2000:细菌或细胞 总数,2000 万。
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