产品名称:天冬酰胺合成酶测试盒
产品规格:50管/48样,100管/96样
产品货号:LE-1-313,LE-2-313
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货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价(元) |
LE-1-313 |
天冬酰胺合成酶测试盒 |
分光光度法 |
50管/48样 |
580 |
LE-2-313 |
天冬酰胺合成酶测试盒 |
微量法 |
100管/96样 |
1100 |
天冬酰胺合成酶测试盒检测试剂盒说明书(分光光度法)
货号:LE-1-313
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
天冬酰胺合成酶是广泛存在于生物体内的一类氨基转移酶,催化谷氨酰胺的氨基向天冬氨酸转移。当植物处于氨毒时天冬酰胺的形成是一种解毒反应。
测定原理:
AS催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸和氨,利用奈氏试剂检测氨增加的速率,即可计算其酶活性。
需自备仪器和用品:
台式离心机、可见分光光度计、水浴锅、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体 60mL×1 瓶,4 ℃保存;
试剂二:粉剂×2 瓶,4 ℃避光保存;临用前每瓶加入 12.5mL 蒸馏水充分溶解待用,现配现用;
试剂三:液体 30 mL×1 瓶,常温保存;
试剂四:液体 10 mL×1 瓶,常温保存;
试剂五:液体 6 mL×1 瓶,常温保存;
试剂六:液体6 mL×1瓶,常温避光保
粗酶液提取:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个): 试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 420nm,蒸馏水调零。
2、样品测定(在 EP 中加入下列试剂):
试剂名称(uL) |
测定管 |
对照管 |
样本 |
25 |
|
蒸馏水 |
|
25 |
试剂一 |
100 |
100 |
试剂二 |
400 |
400 |
混匀,37℃水浴 1 小时
试剂三 |
525 |
525 |
混匀,8000 g,25℃离心 10 min;取上清液,在 EP 管中加入下列试剂
上清液 |
650 |
650 |
试剂四 |
150 |
150 |
试剂五 |
100 |
100 |
试剂六 |
100 |
100 |
混匀,室温静置 15min,420nm 处读取吸光值 A,计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。对照管只要做一管
注意:
1、试剂六如出现沉淀,静置后取上清使用。
2、ΔA(A 测定管-A 对照管)若出现负值,可能是酶活性较低,可将反应时间 1h 延长到 2h,相应的在计算公式中除以 2。
酶活性计算:
标准条件下测定的回归方程为 y =3.8488x +0.0057,R2 = 0.9983;;x 为标准品浓度(μmol/mL),y 为吸光值 A。
1、血清(浆)AS 活性
单位定义:每 mL 血清(浆)每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。
AS(nmol /min /mL)= (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反总÷V 样÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)
2、组织、细菌或细胞 AS 活性
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每 mg 蛋白质每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。
AS(nmol /min /mg prot)= (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位定义:每 g 组织每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。
AS(nmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0057)÷3.8488×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T×1000
=181.8×(ΔA -0.0057)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位定义:每 1 万个细菌或细胞每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。
AS(nmol/min/104 cell)=(ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反总÷(500× V 样÷V 样总)÷T×1000
=0.3637×(ΔA-0.0057)
V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,60min;V 反总:反应体系总体积,1.05mL;V 样:加入反应体系中样本体积,0.025mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万; 1000,μmol 到 nmol 换算系数。
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