货号：LE-1-338

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

磷酸戊糖途径途径中6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）和6PGDH依次催化NADPH合成，与能量的平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。此外，6PGDH 逆境生理中具有重要作用。

测定原理：

6PGDH 催化6-磷酸葡萄糖酸和 NADP+生成 NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340nm 吸光度增加速率，计算 6PGDH 活性。

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL 石英比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前配制，加入 5 mL 试剂一，混匀。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前配制，加入 5 mL 试剂一，混匀。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10 ⁴ 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清、培养液等液体：直接测定。

测定操作：

1. 分光光度计预热 30min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一置于25℃或者 37℃水浴预热30min。

3. 空白管：取1mL石英比色皿，依次加入100μL 蒸馏水，100μL 试剂二，700μL试剂一，100μL 试剂三，于 340nm 处测定 3min 内吸光值变化，第 10s 吸光值记为 A1，第 190s 吸光值记为 A2。△A 空白管=A2-A1

4. 测定管：取 1mL石英比色皿，依次加入100μL 粗酶液，100μL试剂二，700μL试剂一，100μL 试剂三，于 340nm 处测定 3min 内吸光值变化，第 10 s 吸光值记为 A3，第 190s 吸光值记为 A4。△A 测定管=A4-A3

注意：空白管只需要做一次。

计算公式：

（1） 按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为1个酶活单位。

6PGDH 酶活性(nmol/min/mg prot)= [(△A测定管-△A空白管)×V 反总÷ε÷d×10⁹]÷(Cpr×V样)÷T= 535.9×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。

6PGDH 酶活性(nmol/min/g) = [(△A 测定管-△A 空白管)×V 反总÷ε÷d×10⁹]÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 535.9×(△A测定管-△A空白管)÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：每 10 4 个细胞每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。

6PGDH 酶活性(nmol/min/10⁴ cell) = [(△A 测定管-△A 空白管)×V 反总÷ε÷d×10⁹ ]÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 535.9×(△A 测定管-△A 空白管)÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：每毫升液体每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。

6PGDH 酶活性(nmol/min/mL) = [(△A 测定管-△A 空白管)×V 反总÷ε÷d×10⁹]÷V 样÷T= 535.9×(△A 测定管-△A 空白管)

ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1 cm；V 反总：反应体系总体积，0.001 L；Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定，建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒；V 样：反应体系中加入粗酶液体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，3 min。

注意事项：

1、样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在提取当日完成酶活性测定，粗酶液避免反复冻融；

2、试剂二和试剂三须现配现用，当天未用完试剂保存在 4℃，可保存 2 天。