维生素 B1 含量检测试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-281

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

维生素 B1（Vitamin B1）是构成脱羧辅酶的主要成分，参与细胞代谢中的三羧酸循环，是维 持机体正常代谢必须的水溶性维生素 ，在生物体能量代谢中有重要的作用。

测定原理

VB1 在碱性条件下还原铁氰化钾生成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾与 Fe³⁺ 在弱酸条件下生成普鲁士蓝，在 704nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、离心机、可见分光光度计、恒温水浴锅、 1 mL 玻璃比色皿、蒸馏水 。

试剂组成和配制

提取液：液体 35mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 1mL×1 瓶 ，4℃保存。

试剂二： 液体 5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体 12mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。

样本处理

1、组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积(mL)为  1： 5~10  的比例（建议称取约 0.1g，加入 0.6mL 提取液）加入提取液，60℃浸提 30min，加蒸馏水 0.4mL，混匀后于 25℃, 13000g 离心 10min，取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心 20-30 分钟）。

2、细胞： 按照细胞数量（10⁴ 个）： 提取液体积（mL）为 500~1000： 1  的比例（建议  500 万细胞加入 0.6mL 提取液）， 冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）； 加蒸馏水 0.4mL，混匀后于 25℃,   13000g 离心 10min，取上清测定。

3、血清： 直接测定。

测定操作

计算公式

标准曲线：y = 0.017x+0.0031，R² = 0.9991 ；x 为标准品浓度：μg/mL；y 为△A（A 测定管 -A 空白管）

1、按照蛋白含量计算

VB1 含量(μg/mg prot）= (△A-0.0031）÷ 0.017÷Cpr

= 58.8×(△A-0.0031）÷ Cpr

2、按照样本质量计算

VB1 含量(μg/g 鲜重）= (△A-0.0031）÷ 0.017÷（W÷V 样总）

= 58.8×(△A-0.0031）÷ W

3、按照细胞数量计算

VB1 含量(μg/10⁴ cell）= (△A-0.0031）÷ 0.017÷（细胞数量÷V 样总）

= 58.8×(△A-0.0031）÷  细胞数量

4、按照液体体积计算

VB1 含量(μg/mL）= (△A-0.0031）÷ 0.017 

= 58.8× (△A-0.0031）

V 样总：加入提取液体积， 1mL； Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意事项

1、若测定结果中吸光值超过 1，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

2、蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再测定， 在计算公式中乘以稀释倍数。

3、显色完成后立即进行测定。

4、标准曲线线性范围为 0.1-10μg/mL。