注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

AAO是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶”家族。细胞壁内的抗坏血酸和AAO与细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。AAO 氧化AsA所形成的 MDHA 可通过质膜上的细胞色素 b还原，该过程中电子的跨膜运输能够促进细胞生长。

测定原理：

AAO可直接氧化 AsA，通过测定AsA的氧化量，可计算得AAO活力。

实验中所需仪器及设备：

低温离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水充分溶解。

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

AAO 测定操作：

1. 分光光度计预热30 min，调节波长到265nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在25℃水浴锅中预热30 min。

3. 依次在1mL石英比色皿中加入100μL上清液、850μL预热的试剂二和50μL试剂三，迅速混匀后在265nm 测定10s和130s光吸收A1和A2，△A =A1-A2。

AAO 活性计算公式：

(1). 按蛋白浓度计算

AAO 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol AsA为1个酶活单位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反总×10⁹ ÷(Cpr×V 样)÷T

= 92.4×△A÷Cpr

(2). 按样本质量计算

AAO 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol AsA 为1个酶活单位。

AAO(nmol/min/g) = △A÷(ε×d）×V 反总×10⁹ ÷(W×V 样÷V 样总)÷T

= 92.4×△A÷W

ε：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1 cm；V 反总：反应体系总体积（L），1000μL=1×10^-3 L；10⁶ ：1mol=1×10⁹ nmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），100μL=0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：催化反应时间（min），2min。

注意事项:配制好的试剂放在 4℃保存，三天内使用完。