抗坏血酸氧化酶（AAO）活性测定试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-276

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

AAO 是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶”家族。细胞壁内的抗坏血酸和AAO 与细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。AAO  氧化 AsA  所形成的 MDHA  可通过质膜上 的细胞色素 b 还原，该过程中电子的跨膜运输能够促进细胞生长。

测定原理：

AAO 可直接氧化 AsA，通过测定 AsA 的氧化量，可计算得 AAO 活力。

实验中所需仪器及设备：

低温离心机、紫外分光光度计、 1mL石英比色皿、可调式移液器、研钵、冰、 蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 60mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×2 瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。16000g ，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

AAO 测定操作：

1、 分光光度计预热 30 min，调节波长到 265 nm，蒸馏水调零。

2、 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3、 取 1 瓶试剂三，加入 2mL 蒸馏水充分溶解；配好的试剂三 3 天内用完。

4、 工作液的配制：将试剂二与试剂三按 17(mL）:1(mL)的比例混合，用多少配多少。

5、 依次在 1 mL 石英比色皿中加入 100μL 上清液和 900μL 工作液，迅速混匀后在 265nm 测 定 10 s 和 130 s 光吸收 A1 和 A2 ，△A =A1-A2。

AAO 活性计算公式：

1、按蛋白浓度计算

AAO 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反总×10⁹÷(Cpr×V 样)÷T 

= 92.4×△A÷Cpr

2、按样本质量计算

AAO 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

AAO(nmol/min/g 鲜重) = △A÷(ε×d）×V 反总×10⁹÷(W×V 样÷V 样总)÷T 

= 92.4×△A÷W

ε：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×10⁴  L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1 cm；V 反 总：反应体系总体积（L），1000μL=1×10^-3   L；10⁶ ：1mol=1×10⁹ nmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），100μL=0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W，样 本质量，g；T：催化反应时间（min），2min。