单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-278

测定意义：

MDHAR 催化 MDHA 还原生成 AsA ，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

测定原理：

MDHAR  催化 NADH  还原 MDHA  生成 AsA 和 NAD+ ，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰， 但是 NAD+没有。通过测定 340 nm 光吸收下降速率，来计算出MDHAR 活性。

实验中所需仪器及设备：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液枪和双蒸水 试

剂组成和配置：

试剂一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 50mL×1 瓶，室温保存。

试剂三：粉剂×1瓶（棕色），4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水充分溶解。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水充分溶解。

试剂五：液体 25 μL×1 瓶，4℃保存。临用前加 5mL 试剂二充分溶解。

粗酶液提取：

1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织， 加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g ，4℃离心 10min ，取上清置冰上待测。

2、 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为 500~ 1000：1 的比例（建 议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w ，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；8000g  ，4℃离心 20min ，取上清液置冰上混匀待测。

3、血清等液体：直接测定。

MDHAR 测定操作：

1.  分光光度计预热 30 min ，调节波长到 340 nm ，蒸馏水调零。

2.  试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3.  依次在比色皿中加入 100μL 试剂三、100μL 试剂四、100μL 试剂五和 600μL 试剂二，最 后加入 100μL 上清液，迅速混匀后于 340nm 比色，记录 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2 ， △A=A1-A2。

MDHAR 活性计算公式：

1、按蛋白浓度计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH  为 1 个酶活单位。 

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷（Cpr×V 样）÷T= 804×△A ÷Cpr

2、按样本质量计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol NADH  为 1U 。 

MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷（W×V 样÷V 样总）÷T= 804×△A ÷W

3、按细胞数量计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每 10⁴ 个细胞每分钟氧化 1nmol NADH  为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T = 804×△A ÷  细胞数量

4、按液体体积计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫升液体每分钟氧化 1nmol NADH  为 1 个酶活单位。 

MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷V 样）÷T= 804×△A

ε：NADH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积， 1mL=0.001 L ，V 样：加入反应体系中上清液体积，100μL=0. 1mL；Cpr：上清液蛋白浓度， mg/mL ，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量 BCA 试剂盒；V 样总：加 入提取液体积，1mL；W ，样本质量，g；T：反应时间，2min。

注意事项：

临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。