脱氢抗坏血酸（DHA）含量测定试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-274

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

AsA 作为植物细胞一个重要生理指标，其 AsA  的含量、氧化还原状态(AsA/DHA  比率)及其 合成与代谢相关酶类活性的变化涉及植物对一系列环境胁迫的响应。DHA 是 AsA 的可逆的 氧化型，在生物体内，与抗坏血酸共同组成氧化还原系统，具有电子受体的作用。

测定原理：

DTT 还原 DHA 生成 AsA ，通过测定体系中 AsA 的生成速率，即可计算出DHA 含量。

自备仪器和用品：

低温离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 50 mL×1 瓶，室温保存。

试剂二：液体 40 mL×1 瓶，室温保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入 10mL 蒸馏水充分溶解。

标准品：粉剂×1 瓶， 4℃保存。临用前加入 5.743 mL 蒸馏水充分溶解；吸取 0. 1 mL 上述 溶液，加入 0.9 mL 蒸馏水，混匀，即为 100μmol/L DHA。

样品中DHA 提取：

1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织， 加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。12000g ，4℃离心 20min ，取上清置冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为 500~ 1000：1 的比例（建议

500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔7 秒， 总时间 3min）； 12000g ，4℃离心 10min ，取上清液置于冰上待测。

3、血清等液体：直接测定。

DHA 测定操作：

1、 分光光度计预热 30 min ，调节波长到 265 nm ，蒸馏水调零。

2、 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3、 标准管：依次在 1mL 石英比色皿加入 100μL 标准液、800μL 预热的试剂二和 100μL 试剂三，迅速混匀后于 265nm 比色，记录 10s 和 130s 的吸光值 A1 和 A2 ，△A 空白管=A2-A1。4、 测定管：依次在 1mL 石英比色皿加入 100μL 上清液、800μL 预热的试剂二和 100μL 试剂三，迅速混匀后于 265nm 比色，记录 10s 和 130s 的吸光值 A3 和 A4 ，△A 测定管=A4-A3。

注意：标准管只需测定一次。 

计算公式：

1、按蛋白浓度计算

DHA(nmol/mg prot) =[C 标准液×△A 测定管÷ △A 标准管×V 标准]÷（Cpr×V 样） 

= 100×△A 测定管÷ △A 标准管÷Cpr

2、按样本质量计算

DHA(nmol/g 鲜重) =[C 标准液×△A 测定管÷ △A 标准管×V 标准]÷(W×V 样÷V 样总)

= 100×△A 测定管÷ △A 标准管÷W

3、按细胞数量计算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C 标准液×△A 测定管÷ △A 标准管×V 标准]÷(W×V 样÷V 样总) 

= 100×△A 测定管÷ △A 标准管÷细胞数量

4、按液体体积计算

DHA(nmol/mL) =[C 标准液×△A 测定管÷ △A 标准管×V 标准]÷V 样 

= 100×△A 测定管÷ △A 标准管

C 标准液：100μmol/L；V 标准：加入反应体系中标准液体积，0. 1mL；V 样总：上清液总体 积，1.0 mL=0.001 L；V 样：加入反应体系中上清液体积，0. 1mL；W：样品质量，g。

注意事项：

1、临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。

2、最低检出限为 10μmol/L。