脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase ，DHAR）试剂盒说明书（分光光度法 ） 

规格：50 管/48 样

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

DHAR 存在于细胞质、线粒体和叶绿体中。DHAR 催化 GSH 还原 DHA 生成 AsA 和 GSSG， 调控细胞 AsA/DHA 比值，是抗坏血酸-谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶。提高植物体内的 DHAR  活性，可提高植物食品中 AsA 含量，进而提高植物食品的营养品质。

测定原理：

DHAR 催化 GSH 还原 DHA 生成 AsA ，通过测定 DHA 减少速率，计算 DHAR 活性。

实验中所需仪器及设备：

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 50 mL× 1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 35 mL× 1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂× 1 瓶（棕色），4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水充分溶解。

试剂四：粉剂× 1 瓶，4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水充分溶解。

粗酶液提取：

1.    按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g ，4℃离心 10min ，取上清置冰上待测。

2.  细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，

总时间 3min）；8000g 4℃离心 20min ，取上清液置冰上混匀待测。

3.    血清等液体：直接测定。

DHAR 测定操作：

1.  分光光度计预热 30 min ，调节波长到 265nm ，蒸馏水调零。

2.  试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3.  在 1mL 石英比色皿中依次加入 100μL 试剂三、100μL 试剂四和 700μL  试剂二，最后加 100μL 上清液，迅速混匀后于 265nm 比色，记录 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2，△A=A2-A1。 

DHAR 活性计算公式：

( 1).  按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1nmol AsA  为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d ×V 反总× 109÷(Cpr×V 样)÷T= 92×△A ÷Cpr

(2).  按样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成 1nmol AsA  为 1 个酶活单位。 

DHAR(nmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d ×V 反总× 109÷(W ×V 样÷V 样总)÷T= 92× △A ÷W

(3).  按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每 104 个细胞每分钟还原生成 1nmol AsA  为 1 个酶活单位。 

DHAR(nmol/min/ 104 cell) = △A÷ε÷d ×V 反总× 109÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 92× △A ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成 1nmol AsA  为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d ×V 反总× 109÷V 样÷T= 92×△A

ε ：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42× 104  L/mol /cm；109：摩尔分子换算成纳摩尔分子； d：比色杯光径，1 cm；V 反总：反应体系总体积，1mL=0.001 L；V 样：反应体系中加入上 清液体积，100μL=0. 1mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；V 样总：加入提取液体积，1mL； W ，样本质量，g；T：反应时间，2 min。

注意事项：临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。