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产品名称:脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)测试盒

产品规格:50管/48样,100管/96样

产品货号:LE-1-279,LE-2-279

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

LE-1-279

脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)测试盒

紫外分光光度法

50/48

620

LE-2-279

脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)测试盒

微量法

100管/96

1200

脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)试剂盒说明书(紫外分光光度法 ) 

测定意义:

DHAR 存在于细胞质、线粒体和叶绿体中。DHAR 催化 GSH 还原 DHA 生成 AsA 和 GSSG, 调控细胞 AsA/DHA 比值,是抗坏血酸-谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶。提高植物体内的 DHAR  活性,可提高植物食品中 AsA 含量,进而提高植物食品的营养品质。

测定原理:

DHAR 催化 GSH 还原 DHA 生成 AsA ,通过测定 DHA 减少速率,计算 DHAR 活性。

实验中所需仪器及设备:

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体 50 mL× 1 瓶,4℃保存。

试剂二:液体 35 mL× 1 瓶,4℃保存。

试剂三:粉剂× 1 瓶(棕色),4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水充分溶解。

试剂四:粉剂× 1 瓶,4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水充分溶解。

粗酶液提取:

1.    按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~ 10 的比例(建议称取约 0. 1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g ,4℃离心 10min ,取上清置冰上待测。

2.  细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~ 1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,

总时间 3min);8000g 4℃离心 20min ,取上清液置冰上混匀待测。

3.    血清等液体:直接测定。

DHAR 测定操作:

1.  分光光度计预热 30 min ,调节波长到 265nm ,蒸馏水调零。

2.  试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3.  在 1mL 石英比色皿中依次加入 100μL 试剂三、100μL 试剂四和 700μL  试剂二,最后加 100μL 上清液,迅速混匀后于 265nm 比色,记录 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2,△A=A2-A1。 

DHAR 活性计算公式:

1、按蛋白浓度计算

活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1nmol AsA  为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d ×V 反总× 109÷(Cpr×V 样)÷T= 92×△A ÷Cpr

2、按样本质量计算

活性单位定义:25℃中每克样本每分钟还原生成 1nmol AsA  为 1 个酶活单位。 

DHAR(nmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d ×V 反总× 109÷(W ×V 样÷V 样总)÷T= 92× △A ÷W

3、按细胞数量计算

活性单位定义:25℃中每 104 个细胞每分钟还原生成 1nmol AsA  为 1 个酶活单位。 

DHAR(nmol/min/ 104 cell) = △A÷ε÷d ×V 反总× 109÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 92× △A ÷细胞数量

4、按液体体积计算

活性单位定义:25℃中每毫升样本每分钟还原生成 1nmol AsA  为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d ×V 反总× 109÷V 样÷T= 92×△A

ε :AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42× 104  L/mol /cm;109:摩尔分子换算成纳摩尔分子; d:比色杯光径,1 cm;V 反总:反应体系总体积,1mL=0.001 L;V 样:反应体系中加入上 清液体积,100μL=0. 1mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL;V 样总:加入提取液体积,1mL; W ,样本质量,g;T:反应时间,2 min。

注意事项:临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存,3 天内使用完。


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