货号：LE-1-315

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GOGAT分布于植物中，和谷氨酰胺合成酶共同构成 GS/GOGAT 循环，参与氨同化的调控。

测定原理：

GOGAT催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸；同时NADH氧化生成 NAD+，340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存； 

试剂一：液体 60mL×1 瓶，4℃保存； 

试剂二：粉剂×1 支，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 支，4℃保存； 

试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存。

粗酶液提取：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液）， 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃ 离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定

（1）工作液的配制：临用前将试剂二、三、四转移到试剂一中混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；现配现用；

（2）取0.1mL样本和1mL工作液于1mL比色皿中，混匀，加工作液的同时开始计时，在340nm 波长下记录20秒时的初始吸光度A1和5分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。

GOGAT 活性计算：

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GOGAT（nmol /min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V×样 Cpr) ÷T=354×ΔA÷Cpr

2、按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GOGAT（nmol /min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=354×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GOGAT（nmol/min/10⁴cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T =0.708×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1.1×10 ^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。