货号：LE-1-339

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物 、植物 、微生物和培养细胞中，NAD⁺ 是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的 NADH 经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成 ATP 的同时，形成大量的ROS， 同时 NADH  再生为 NAD⁺  。糖 、脂 、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成 。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱 。较高的 NAD(H)及 NADH/NAD⁺ 比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态 。此外，NADH/NAD⁺ 比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环 。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导 、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

测定原理：

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD⁺ 和NADH，NADH 通过 PMS 的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在 570nm 下检测吸光值；而 NAD⁺ 可被乙醇脱氢酶还原为 NADH，进一步采用 MTT 还原法检测。

产品内容：

酸性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

碱性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 14mL×1  瓶，4℃保存；

试剂二：液体 4mL×1 支，4℃保存

试剂三：粉剂×1  瓶 ，-20 ℃保存，用时加入 4ml 蒸馏水，混匀，用不完的试剂 4℃保存一周； 

试剂四：粉剂×1  瓶 ，4 ℃保存，用时加入 4ml 蒸馏水，混匀，用不完的试剂 4℃保存一周；

试剂五：液体 1.8mL×1 支，4 ℃保存；

试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存；

试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存；

自备仪器和用品：

可见分光光度计 、 台式离心机 、移液器 、 1 ml  玻璃比色皿 、研钵 、冰和蒸馏水。

NAD⁺ 和 NADH 的提取 ：

1、血清（浆） 中 NAD⁺ 和 NADH 的提取

NAD⁺ 的提取：按照血清（浆）体积（ml） ：酸性提取液体积（ml） 为  1 ：5~ 10  的比例（建议取约 0.1ml 血清（浆），加入 1ml 酸性提取液） ，95℃水浴  5min（盖紧， 以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心  10min；取  500μl 上清液，加入 500μl 碱性提取液使之中和 ，混匀，10000g 4 ℃离心  10min，取上清，置冰上待测。

NADH 的提取：按照血清（浆）体积（ml） ：碱性提取液体积（ml） 为  1 ：5~ 10  的比例（建议取约 0. 1ml  血清（浆） ，加入 1ml  碱性提取液） ，95℃水浴  5min（盖紧， 以防止水分散失）；

冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取  500μl  上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和 ，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织中 NAD⁺ 和 NADH 的提取：

NAD⁺ 的提取：按照组织质量（g） ：酸性提取液体积（ml） 为  1 ：5~ 10  的比例（建议取约  0. 1g 织，加入 1ml 酸性提取液） ，冰浴研磨，95℃水浴  5min（盖紧， 以防止水分散失） ；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取  500μl  上清液，加入  500μl  碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃ 离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADH 的提取：按照组织质量（g） ：碱性提取液体积（ml） 为 1 ：5~ 10 的比例（建议取约  0. 1g组织，加入 1ml 碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴  5min（盖紧， 以防止水分散失） ；冰浴 中冷却后，10000g 4 ℃离心  10min；取  500μl  上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混匀， 10000g 4 ℃离心  10min，取上清，置冰上待测。

3、细胞或细菌中 NAD⁺ 和 NADH 的提取：

NAD⁺ 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（ 10⁴ 个） ：酸性提取液体积（ml）为 500~ 1000： 1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 酸性提取液）， 超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声  3s， 间隔 10s，重复 30 次） ，95℃水浴  5min（盖紧， 以防止水分散失） ；冰浴中冷却后， 10000g 4 ℃离心  10min；取  500μl 上清液，加入 500μl 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心  10min，取上清，置冰上待测。

NADH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（ 10⁴ 个） ：碱性提取液体积（ml）为 500~ 1000： 1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 碱性提取液）， 超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声  3s， 间隔 10s，重复 30 次） ，95℃水浴 5min （盖紧，以防止水分散失） ；冰浴中冷却后， 10000g 4 ℃离心  10min；取  500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。

2、加样表(在 1.5ml 棕色 EP 管中按下表依次加样）：

充分混匀，静置 5min 后，20000g，25℃离心 5min，弃上清，沉淀中加入：

混匀，570nm 下比色，读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2，计算△A=A2-A1。

注意事项

1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一 、二 、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一 、二 、三 、 四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一 、二 、三 、 四和五后必须反应 20min  后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、若 NAD⁺ 测定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH  测定中△A（A2-A1）≤0.0222， 已低于检测限 ，可做如下调整：

（1）将测定管避光静置时间 20min 延长到  60min；

（2）在提取 阶段增加取样量 ，即取 0.2g 样本或 0.2ml 样本加入 1ml 提取液。

5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 50 管保证测 24 个 NAD⁺ 或 NADH.。

NAD⁺ 和 NADH 含量的计算：

一、NAD⁺ 含量的计算

标准条件下的回归曲线为 y = 0.295x + 0.0302，R² = 0.9978；其中 y 为△A，x 为 NAD+浓度 nmol/ml

1 、血清（浆） 中 NAD⁺ 含量计算

NAD⁺ 含量(nmol/ml）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1) ]÷(V3×V1÷V2)

=67.8×(△A -0.0302）

2 、组织 、细菌或细胞中 NAD⁺ 含量计算

（1）按样本蛋白浓度计算

NAD⁺ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(V1×Cpr)

= 3.4×(△A -0.0302）÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

NAD⁺ (nmol/g  鲜重）= [(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(W×V1÷V2)

= 6.8×(△A -0.0302）÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

NAD⁺ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(500×V1÷V2)

=0.014×(△A -0.0302）

二、NADH 含量的计算

标准条件下的回归曲线为 y = 0.2808x + 0.0222，R² = 0.9976；其中 y 为△A，x 为 NADH 浓度 nmol/ml

1、血清（浆） 中 NADH 含量计算

NADH 含量(nmol/ml）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(V3×V1÷V2)

= 71.2×(△A -0.0222）

2、组织 、细菌或细胞中 NADH  含量计算

（1）按样本蛋白浓度计算

NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(V1×Cpr)

= 3.6×(△A -0.0222）÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

NADH (nmol/g  鲜重）=[(△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(W×V1÷V2)

= 7.1×(△A -0.0222）÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

NADH (nmol/10⁴ cell）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(500×V1÷V2)

=0.014×(△A -0.0222）

V1：加入反应体系中样本体积，0.05ml；V2：加入提取液体积，2ml；V3：加入血清（浆） 体积：0. 1ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数， 500  万。

注意 ：最低检测限为 0.1nmol/ml 或 0.1nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot