正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的 NADH 经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成 ATP 的同时，形成大量的 ROS，同时 NADH 再生为 NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的 NAD(H)及 NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

测定原理：

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH，NADH 通过 PMS 的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在 570nm 下检测吸光值；而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH，进一步采用 MTT 还原法检测。

自备实验用品及仪器：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

酸性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 碱性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 3 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1 瓶，-20 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀，用不完的试剂 4℃保存一周；
试剂四：粉剂×1 瓶，4 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀，用不完的试剂 4℃保存一周；
试剂五：液体 3.6mL×1 瓶，4 ℃保存； 试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存； 试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存。
NAD+和 NADH 的提取：
1 血清（浆）中 NAD+和 NADH 的提取
NAD+的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入1mL 酸性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μ L 上清液，加入 500μ L 碱性提取液使之中和， 混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
NADH 的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入1mL 碱性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μ L 上清液，加入 500μ L 酸性提取液使之中和， 混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2 组织中 NAD+和 NADH 的提取：
NAD+的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g组织，加入 1mL 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μ L 上清液，加入500μ L 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
NADH 的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g组织，加入 1mL 碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μ L 上清液，加入500μ L 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3 细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取：
NAD+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：酸性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液），超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复30 次），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μ L 上清液，加入 500μ L 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
NADH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：碱性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液），超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复30 次），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μ L 上清液，加入 500μ L 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。
2、加样表(在 1.5mL 棕色EP 管中按下表依次加样）：

2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 100 管保证测 48 个 NAD+或 NADH.

NAD+和 NADH 含量的计算：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（一）NAD+含量的计算
1、血清（浆）中 NAD+含量计算
NAD+含量(nmol/mL）=[ (△A -0.099）×36.1×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 722×(△A -0.099）
2、组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NAD+ (nmol/mg prot）=[ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(V1×Cpr)= 36.1×(△A -0.099）÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NAD+ (nmol/g 鲜重）= [ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(W×V1÷V2)= 72.2×(△A -0.099）÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NAD+ (nmol/104 cell）=[ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.1444×(△A -0.099）
（二）NADH 含量的计算
1、血清（浆）中 NADH 含量计算
NADH 含量(nmol/mL）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 494×(△A -0.065）
2、组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(V1×Cpr)= 24.7×(△A -0.065）÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NADH (nmol/g 鲜重）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 49.4×(△A -0.065）÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NADH (nmol/104 cell）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0988×(△A-0.065）
V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
（一）NAD+含量的计算
1、血清（浆）中 NAD+含量计算
NAD+含量(nmol/mL）=[ (△A -0.099）×72.2×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 1444×(△A -0.099）
2、组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NAD+ (nmol/mg prot）=[ (△A -0.099）×72.2×V1)]÷(V1×Cpr)= 72.2×(△A -0.099）÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NAD+ (nmol/g 鲜重）= [ (△A -0.099）×72.2×V1)]÷(W×V1÷V2)= 144.4×(△A -0.099）÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NAD+ (nmol/104 cell）=[ (△A -0.099）×72.2×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.2888×(△A -0.099）
（二）NADH 含量的计算
1、血清（浆）中 NADH 含量计算
NADH 含量(nmol/mL）= [ (△A -0.065）×49.4×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 988×(△A -0.065）
2、组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.065）×49.4×V1) ]÷(V1×Cpr)= 49.4×(△A -0.065）÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NADH (nmol/g 鲜重）= [ (△A -0.065）×49.4×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 98.8×(△A -0.065）÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NADH (nmol/104 cell）= [ (△A -0.065）×49.4×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.1976×(△A-0.065）
V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
注意：最低检测限为 1nmol/mL 或 1nmol/g 鲜重 或 0.01nmol/mg prot