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产品名称:辅酶ⅠNAD(H)测试盒

产品规格:50管/24样,100管/48样

产品货号:LE-1-339,LE-2-339

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

LE-1-339

辅酶ⅠNAD(H)含量测试盒

可见分光光度法

50/24

500

LE-2-339

辅酶ⅠNAD(H)含量测试盒

微量法

100管/48

950

辅酶ⅠNAD(H)含量测定试剂盒说明书(微量法

测定意义:

辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NAD+是糖酵解EMP)和三羧酸循环(TCA)的主要氢受体,生成的 NADH 经呼吸电子链ETC)传递把电子交给氧,在合 ATP 的同时,形成大量的 ROS,同时 NADH 再生为 NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的 NAD(H)及 NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高,处于过氧化状态。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。另外,NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

测定原理:

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+ NADH,NADH 通过 PMS 的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝MTT)为甲瓒,在 570nm 下检测吸光值;而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH,进一步采用 MTT 还原法检测。

自备实验用品及仪器:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

酸性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存; 碱性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存; 试剂一:液体 10 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:液体 3 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂三:粉剂×1 瓶,-20 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀,用不完的试剂 4℃保存一周;

试剂四:粉剂×1 瓶,4 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀,用不完的试剂 4℃保存一周;

试剂五:液体 3.6mL×1 瓶,4 ℃保存; 

试剂六:液体 30mL×1 瓶,4 ℃保存; 

剂七:液体 50mL×1 瓶,4 ℃保存。

NAD+和 NADH 的提取:
1 血清(浆)中 NAD+和 NADH 的提取
NAD+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆),加入1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μ L 上清液,加入 500μ L 碱性提取液使之中和, 混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆),加入1mL 碱性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μ L 上清液,加入 500μ L 酸性提取液使之中和, 混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2 组织中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g组织,加入 1mL 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μ L 上清液,加入500μ L 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g组织,加入 1mL 碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μ L 上清液,加入500μ L 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3 细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):酸性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μ L 上清液,加入 500μ L 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADH 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):碱性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μ L 上清液,加入 500μ L 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 570nm,蒸馏水调零。
2、加样表(在 1.5mL 棕色EP 管中按下表依次加样):

试剂名称(μ L)

对照管

测定管

样本

20

20

试剂一

80

80

试剂二

30

30

试剂三

30

30

试剂四

30

30

试剂五

30

30

试剂六

200

混匀,室温避光静置 20min

试剂六

 

200

充分混匀,静置 5min 后,20000g,25℃离心 5min,弃上清,沉淀中加入:

试剂七

400

400

混匀,取 200μ L 转移至微量石英比色皿或 96 孔板中570nm 下读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2,计算△A=A2-A1。

注意事项:

1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六;测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒 100 管保证测 48 个 NAD+ NADH.

NAD+和 NADH 含量的计算:

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(一)NAD+含量的计算
1、血清(浆)中 NAD+含量计算
NAD+含量(nmol/mL)=[ (△A -0.099)×36.1×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 722×(△A -0.099)
2、组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NAD+ (nmol/mg prot)=[ (△A -0.099)×36.1×V1)]÷(V1×Cpr)= 36.1×(△A -0.099)÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NAD+ (nmol/g 鲜重)= [ (△A -0.099)×36.1×V1)]÷(W×V1÷V2)= 72.2×(△A -0.099)÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NAD+ (nmol/104 cell)=[ (△A -0.099)×36.1×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.1444×(△A -0.099)
(二)NADH 含量的计算
1、血清(浆)中 NADH 含量计算
NADH 含量(nmol/mL)= [ (△A -0.065)×24.7×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 494×(△A -0.065)
2、组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot)= [ (△A -0.065)×24.7×V1) ]÷(V1×Cpr)= 24.7×(△A -0.065)÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NADH (nmol/g 鲜重)= [ (△A -0.065)×24.7×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 49.4×(△A -0.065)÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NADH (nmol/104 cell)= [ (△A -0.065)×24.7×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0988×(△A-0.065)
V1:加入反应体系中样本体积,0.02mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆)体积:0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
(一)NAD+含量的计算
1、血清(浆)中 NAD+含量计算
NAD+含量(nmol/mL)=[ (△A -0.099)×72.2×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 1444×(△A -0.099)
2、组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NAD+ (nmol/mg prot)=[ (△A -0.099)×72.2×V1)]÷(V1×Cpr)= 72.2×(△A -0.099)÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NAD+ (nmol/g 鲜重)= [ (△A -0.099)×72.2×V1)]÷(W×V1÷V2)= 144.4×(△A -0.099)÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NAD+ (nmol/104 cell)=[ (△A -0.099)×72.2×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.2888×(△A -0.099)
(二)NADH 含量的计算
1、血清(浆)中 NADH 含量计算
NADH 含量(nmol/mL)= [ (△A -0.065)×49.4×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 988×(△A -0.065)
2、组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot)= [ (△A -0.065)×49.4×V1) ]÷(V1×Cpr)= 49.4×(△A -0.065)÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NADH (nmol/g 鲜重)= [ (△A -0.065)×49.4×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 98.8×(△A -0.065)÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NADH (nmol/104 cell)= [ (△A -0.065)×49.4×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.1976×(△A-0.065)
V1:加入反应体系中样本体积,0.02mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆)体积:0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
注意:最低检测限为 1nmol/mL 或 1nmol/g 鲜重 或 0.01nmol/mg prot


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